细胞复苏、传代与冻存操作流程

仪器与试剂

护目镜、厚毛线手套等

操作流程

复苏

1）将恒温水浴锅中的水预热到 37℃；

2

）准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的wan全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；

3

）戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；

4

）将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准中，混匀后，1000rpm 离心 5min；

5

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

传代

（细胞传代建议一传二）

1.

当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。

2.

在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；

3.

向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS  后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS；

4.

冻存

（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）

1~6

）参照传代步骤

7）离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；

8）将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；

9）第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。